Detergent的性质及其在膜蛋白中的应用

1. 去垢剂的结构

去垢剂属于表面活性剂，应用广泛，包括：聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE）、包涵体的溶解、脂质体的制备、膜蛋白溶解和活性结构研究等。并且，去垢剂在体外研究中也可以作为模型膜。

去垢剂的功能与其结构有关：去垢剂分子的极性亲水部分被作为亲水头部基团（hydrophilic head group），而非极性疏水部分被作为尾巴（tail）。也有一些去垢剂是豆状分子形状(Figure 1B)，它们有极性和非极性的面，包括bile acid derivatives，例如CHAPS和CHAPSO。

2. 去垢剂的分类

根据去垢剂亲水基团的不同可以将去垢剂分为离子型（阳离子or阴离子）、非离子型和两性离子型。

离子型去垢剂包括十二烷基硫酸钠（SDS）、N-月桂基肌氨酸(N-lauryl sarcosine)、CTAB等，能从膜中有效地提取蛋白。这些去垢剂能有效地破坏分子内和分子间蛋白之间的相互作用，性质苛刻，倾向于将蛋白变性。其中，胆酸盐类（Bile acid salts），例如胆酸钠(sodium cholate)和脱氧胆酸(deoxycholic acid)，也是离子型去垢剂，但它们的骨架由刚性类固醇组成，比直链离子去垢剂更温和。

非离子型去垢剂包括麦芽糖苷（maltosides）、葡萄糖苷（glucosides）和聚氧乙烯二醇（polyoxyethylene glycols），特点是亲水头部基团不带电荷。这些去垢剂温和、非变性，破坏蛋白-脂质和脂质-脂质相互作用。

两性离子去垢剂包括Zwittergents，Fos-Cholines，CHAPS/CHAPSO等，亲水头部基团包含正负电荷。这些去垢剂像非离子型去垢剂一样是电中性的，但通常能像离子型去垢剂一样破坏蛋白之间相互作用，因此温和程度介于中间。大部分成功的膜蛋白NMR研究利用的两性去垢剂，例如Fos-Choline 12。

3. 关于去垢剂的几个概念

3.1 临界胶束浓度（The critical micelle concentration，CMC）

当考虑去垢剂应用时，胶束化是一个关键现象。每一种去垢剂都有一个CMC值，当去垢剂浓度高于CMC时，单体自组装成非共价聚集体，也叫胶束micelles。胶束化实际上不在一个单一浓度内发生，而是在一个窄的浓度范围内发生。

当作用于膜蛋白时，一个经验法则是：去垢剂的工作浓度至少是2xCMC，而去垢剂:蛋白的重量比至少是4:1。当从原始膜中溶解膜蛋白时，去垢剂的工作浓度远高于CMC，并且去垢剂与脂质的摩尔比是10:1。因此CMC决定了需要向各种蛋白和膜制品中加入去垢剂的量 ^[2]。

去垢剂的CMC值并不是固定的，它会随着溶液中pH，离子强度和温度的改变发生变化 ^[3]。例如离子型去垢剂的CMC会随着溶液中离子强度的增加而降低。

3.2 胶束化（Micellization）

胶束是溶液中去垢剂单体的聚集体，形成胶束的过程被称为胶束化 ^[4]。去垢剂以胶束的形式与膜蛋白和膜相互作用，蛋白的溶解依赖于溶液中胶束的形成。胶束通常被认为有着“粗糙”的表面，是动态的结构。胶束内的去垢剂单体与溶液中游离的去垢剂单体快速交换。膜蛋白一旦被溶解，我们通常认为去垢剂分子在疏水跨膜域周围形成环面。

4. 去垢剂在膜蛋白中的应用

4.1 去垢剂的替换或去除

可以有效溶解膜蛋白的去垢剂也可能不适宜做进一步的生物化学研究，这个时候需要将膜蛋白转移到一个更合适的去垢剂溶液中。当组装liposomes或nanodiscs时，需要去除去垢剂。当考虑替换或去除不需要的去垢剂时，CMC用来确定可用的方法。高CMC的去垢剂易通过透析除去，去垢剂溶液能通过透析稀释到CMC值以下，此时胶束分解为单体，单体能容易地穿过透析膜。一般情况下，去垢剂溶液用超过200倍体积的不含去垢剂的缓冲透析几天，中间几次换液，例如Fos-Choline 12。低CMC去垢剂一般通过疏水珠吸附除去，例如DDM。还可以通过镍柱纯化，当膜蛋白结合到柱材料后，换含有另一种去垢剂溶液的缓冲即可。

4.2 膜蛋白的鉴定

SDS-PAGE跑胶鉴定膜蛋白时，煮沸处理可能会导致膜蛋白的聚集。可以在室温孵育10min，再直接跑胶。膜蛋白通常不会迁移在SDS-PAGE上预测分子量的位置处。它们一般会迁移得快一些（也就是看起来较小），这可能是因为折叠得不完全或者每个分子量单位比水溶性蛋白结合了更多的SDS的原因 ^[5]。

5. 膜蛋白的表达

刚刚介绍了关于去垢剂的基本性质，但实际上制备膜蛋白是非常困难的。大部分的膜蛋白不能从天然环境中足量获得，需要尝试过度表达。不幸的是，通过大肠或其他系统，很难获得足量的有功能性且稳定的膜蛋白。通常，跨膜次数越高的膜蛋白越难表达，例如包含6次跨膜域的水通道蛋白。

5.1 水通道蛋白

水通道蛋白，是一种位于细胞膜上的6次跨膜蛋白质，在细胞膜上组成“孔道”，可控制水在细胞的进出。水分子经过水通道蛋白时会形成单一纵列，进入弯曲狭窄的通道内，内部的偶极力与极性会帮助水分子旋转，以适当角度穿越狭窄的通道。

水通道蛋白主要大量存在于哺乳动物的肾脏，也存在于植物中。水通道在肾脏尿浓缩、消化生理、神经生理、呼吸生理、眼球生理和皮肤生理等中都有作用。

5.2 水通道活性蛋白

CUSABIO采用大肠无细胞蛋白表达技术。该技术不受细胞结构的限制，适于表达对细胞有毒害作用的膜蛋白和毒性蛋白，产量高达mg/ml。按照基于细胞的传统表达方式，常规处理膜蛋白需要破坏细胞膜，这往往会引起插入其内的膜蛋白的构象变化甚至变性。而大肠无细胞开放的无细胞体系，可以体外多途径优化表达产量，并且在表达中，表达的膜蛋白可以在翻译后立马被去垢剂包裹，最大限度的避免暴露在水溶液中。现已开发以下活性水通道蛋白。

Recombinant Escherichia coli Aquaporin Z (aqpZ)

Function: Channel that permits osmotically driven movement of water in both directions. It is involved in the osmoregulation and in the maintenance of cell turgor during volume expansion in rapidly growing cells. It mediates rapid entry or exit of water in response to abrupt changes in osmolarity.

aqpZ in detergent micelles

(Tris-Glycine gel) Discontinuous SDS-PAGE (reduced) with 5% enrichment gel and 15% separation gel.

The binding activity of aqpZ with ytfE.

Activity: Measured by its binding ability in a functional ELISA. Immobilized aqpZ at 5 μg/ml can bind E.coli ytfE, the EC₅₀ of E.coli ytfE protein is 197.90-259.70 μg/ml.