ELISA检测影响因素浅析

一、样品方面

ELISA作为一项成熟的检测技术，适用于多种样本的检测。其中血清、血浆、尿液、唾液等样本较为常见，规范的取样操作、合适的存放条件都是保证检测结果准确的必要条件。

实际上，样本采集、存放过程中很多因素可能引起检测结果的差异，如溶血样本由于红细胞裂解释放出具有过氧化酶活性的物质，进而发生非特异性显色反应，产生假阳性 ^[2]；部分资料显示，对于溶血样本，可以测定血清Hb浓度判断溶血程度。非溶血标本血清游离Hb为4.8±3.2mg/dL，中度溶血血清Hb为43.5±13.9mg/dL。超过此范围的样本最好做复检，避免假阳性结果。依据检测指标，选择合适的样本，而对于较为敏感指标（如LDH、ACP等），即使轻微溶血也可能导致测定结果偏高，此类样本应尽量避免使用。对于溶血判断，较为简易便捷的方法则是肉眼观察，当血清清亮，呈樱红色，为中度溶血，此时需重新采集。为更好避免溶血情况发生，建议SST管或抗凝管采样。高脂血同样也是比较常见的，严重的也称为牛奶血，呈乳白色或混浊状，其通过不均一性、脂质颗粒粘附在管壁等影响检测结果。理论采用高速离心可除去，但可能对检测结果有影响。

另外，样本污染或存放不当都会对检测结果造成影响，如样本受到细菌污染，则会产生非特异性显色而干扰结果；塑料管能吸附抗原使样本内抗原含量下降，容易假阴性，最好使用真空采血管。

二、操作方面

ELISA是一项可重复性很高的检测技术，操作简便易行，但操作中的各个环节对实验的检测效果影响较大，正确严格的操作是保证实验成果的关键。

对于加样：ELISA是基于微孔板的反应，所需样本量较小，若样本粘附于孔壁或加样量不足，微孔板内样本量不足以参与与抗原或抗体的反应，则会出现假阴性结果。因此充足的样本量是首要条件，考虑使用准确性高的移液器且定期进行校正，加样时宜垂直悬空加入微孔底部，需注意避免碰到管底或管壁，防止溅出或产生气泡，同时更换枪头，做到“一样一吸头”，避免交叉污染。

对于温育：ELISA是基于抗原抗体特异性结合的反应，抗原抗体反应需要合适的温度。对于大多数抗原抗体，37℃是最佳反应温度，结合效率最高。ELISA操作中需将酶标板置于合适的温度温育，由于酶标板结构特别，较易产生边缘效应，同时基于很多恒温箱构造，温度显示并非酶标板温育温度，导致个别样本检测结果异常。可选用水浴法温育，避免受热不均产生边缘效应，同时贴上密封膜防止污染或液体蒸发 ^[3]，切勿缩短温育时间。

对于洗板：其目的在于除去非特异性成分，使免疫复合物与待测抗体 (抗原) 呈一定比例，洗板是ELISA操作中重要的环节。有条件的实验室，可采用机洗，可在一定程度避免污染，提高效率，需注意观察洗液针、冲洗头是否通畅 ^[4]，这是考虑到血清中残留纤维蛋白丝或洗涤液有析出的结晶存在时，易使洗板机针孔阻塞；调整注水量，设置好洗板时间及次数、力度，避免力度过大造成酶结合物丢失，检测结果偏低。对于不方便的实验室，则可用手洗，可反复模拟操作，避免洗板不干净造成“花板”，影响检测结果。洗板结束后将板垂直扣于干净的吸水纸或毛巾上，拍干。

对于显色及判读：ELISA多用HRP为催化酶，作用于TMB发生显色。显色是最后一步温育反应，研究表明，显色温度对实验结果有明显影响，温度过低导致结合反应速率变慢，显色不充分，容易漏检低值结果。而显色时间不宜过短，鉴于一些低滴度可能不能及时出现反应，造成假阴性结果。严格控制显色反应的温度和时间至关重要。ELISA测定需要通过酶标仪测定，研究资料建议首选双波长，可以减少测定干扰和电路干扰 ^[1]，提高临界值处的样本的分析正确度，减少对弱阳性样本的漏检，从而减少实验误差。

三、试剂方面

市场ELISA产品众多，眼花缭乱，参差不齐，高质量的产品仍然是重中之重 ^[5]，也是保证实验结果可靠的先决条件。选择知名度相对高的试剂。切忌不要混用，更不要使用过期试剂。实验操作前，通常需将试剂从冰箱拿出，平衡30-60min，使微孔内温度较快达到所需温度，而忽略这一操作可能导致一些弱阳性的样本出现假阴性。

综上所述，影响ELISA结果的因素有很多，无论是样品、操作还是试剂都可能影响到最终的实验结果。因此，在进行ELISA检测时，要采取相应措施排除干扰因素，同时严格执行SOP标准化规程，认真做好ELISA全程质量控制，保证ELISA检测结果的准确度 ^[6]。