如何选择上样对照抗体

1. 在Western blot中负载对照抗体的目的是什么?

估计每个泳道中加载的总蛋白质量。这个信息是为了确定在不同样本中感兴趣蛋白质水平的差异是否由于加载和转移错误，还是由于蛋白质表达的真实变化。

对Western blot过程进行故障排除。负载对照抗体可以帮助确定实验过程中是否存在问题，并帮助确定可能的错误来源。

2. 在实验中选择合适的负载对照抗体的重要因素是什么?

如前所述，负载对照抗体是可以监测整个检测系统是否正常的参考对象，如蛋白质提取过程、膜转移系统、颜色显像系统等。也可用于比较不同条件下不同细胞组织中靶蛋白的表达。在选择合适的载药对照抗体作为内参时，需要注意以下几个方面。

样本来源：在哺乳动物组织或细胞中，主要代表性的负载对照抗体有肌动蛋白、微管蛋白、GAPDH、Lamin B1和PCNA。但如果是植物样本，主要代表性的负载对照抗体有肌动蛋白和GAPDH。

目标蛋白分子量：常见的负载对照抗体包括β肌动蛋白、β微管蛋白和GAPDH，它们的分子量分别为42 kDa、50 kDa和37 kDa。目标蛋白的分子量最好与内部参考蛋白的分子量相差5 kDa以上，以便区分目标蛋白和内部参考蛋白。

目标蛋白的表达位点：在不同的表达位点，基础蛋白的特征不同。例如，微管蛋白、β肌动蛋白和GAPDH是全细胞蛋白，PCNA的定位在细胞核，Lamin B1位于核膜等。表格1总结了常见基础蛋白的特点，包括名称、类型和分子量。

表1. 常见管家蛋白的特征

3. 五种常见的负载对照抗体

在这部分中，我们列出了CUSABIO提供的五种常见的负载对照抗体。

3.1 Beta-Actin负载对照抗体

肌动蛋白是细胞的重要细胞骨架蛋白，可以大致分为六种类型。其中，四种肌动蛋白是特异性表达于不同肌肉组织中，而其他两种则广泛分布于各种组织中，包括β-肌动蛋白和γ-非肌肉肌动蛋白。β-肌动蛋白被认为是大多数组织和细胞的内部参考基因。

β-肌动蛋白广泛分布于细胞质中，在所有细胞的总蛋白中丰度较高，约占总蛋白的50%。然而，在一些特殊情况下，如脂肪组织或细胞内，β-肌动蛋白的表达量很低。它由375个氨基酸组成，分子量约为42-43 kDa。它适用于在WB实验中检测38kD-48kD大小的目标蛋白。但是，在脂肪组织中，β-肌动蛋白的表达量非常低，不适合作为内部参考基因。

3.2 GAPDH负载对照抗体

GAPDH，也称为糖酵解中的糖醛酸-3-磷酸脱氢酶，是参与糖酵解的关键酶。它由四个亚单位组成（每个亚单位约为30-40 kDa），其分子量约为146 kDa，检测带大约为36 kDa。GAPDH基因在几乎所有组织中表达水平高，并且可以广泛用作Western blot蛋白质标准化的内部参考基因。但请注意，在WB实验中，它不适用于检测30kD-40kD大小的目标蛋白。此外，在某些细胞中，由于组织缺氧、糖尿病等因素会导致GAPDH的表达增加，因此也不适合作为内部参考基因。

3.3 β-Tubulin负载对照抗体

微管蛋白和肌动蛋白一样，也是一种细胞骨架蛋白。微管蛋白可分为α、β、γ、δ、ε等多种微管蛋白。其中，α-Tubulin和β-Tubulin可形成异二聚体，是形成微管的两种主要的Tubulin类型。α-微管蛋白和β-微管蛋白的相对分子质量分别为55kDa和50kDa，其实际检测条带均在55kDa左右。

β-tubulin作为内部参考，通常不会发生蛋白水平的变化，因此更广泛地用于Western Blotting中样品上样是否一致的参考，并常用于免疫染色观察细胞的微管结构。但是，需要注意的是，对于50kD-60kD大小的目标蛋白不适合进行WB实验。此外，在脂肪组织或细胞中，β- Tubulin很少表达，不适合作为内部参考。

3.4 PCNA负载对照抗体

增殖细胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen，简称PCNA）最早于1978年由Miyachi在SLE（全身性红斑狼疮）患者的血清中发现并命名，仅在正常增殖细胞和肿瘤细胞中存在。PCNA是一种分子量为36kDa的蛋白质，其在细胞核中合成，并存在于细胞核中，是DNA聚合酶的辅助蛋白。由于其在细胞核中的稳定表达，其抗体被广泛应用于核蛋白的内部参考抗体中。

除了Histone H3和PCNA之外，其他常见的核蛋白内部参考还包括K70、K80、Lamin A和B。在一些研究中，还使用Erk2、TATA结合蛋白（TBP）、c-Jun、c-Fos等。然而，除了考虑目标蛋白的分子量之外，选择核蛋白内部参考还需要考虑实际的实验环境。例如，在涉及细胞增殖的实验中，由于其自身表达的变化，c-Jun不适合作为内部参考。在这种实验中，TBP、Lamin等也不适合作为内部参数。

3.5 COX IV负载对照抗体

细胞色素c氧化酶（Cytochrome c oxidase，简称COX）是线粒体呼吸链的酶复合物，是一个异源多聚酶，通常包含13个亚单位，位于线粒体内膜上。形成细胞色素c氧化酶催化中心的三个最大的亚单位由线粒体DNA编码，剩余的10个亚单位，包括COX IV，由细胞核内的基因组DNA编码。细胞色素c氧化酶（COX）活性缺陷与多种人类疾病相关。COX IV抗体可以用作线粒体蛋白质加载的内部参考抗体，目标蛋白的大小约为16 kDa。