细胞活力概述
日期：2023-12-06 16:02:00
细胞基础实验是用于研究许多生化或细胞功能的通用工具，包括细胞增殖、形态学、迁移、凋亡、遗传学和信号转导等。与体内研究相比，体外细胞基础实验更便宜，并且可以高通量进行。细胞基础实验通常用于细胞毒性测试，以评估药物的功效，确定主要研究的作用机制（MOA），以及确定患者产生的抗体是否能中和药物产品。细胞基础实验的前提是确保培养基中的细胞是活的。在进行细胞基础实验之前，应该评估细胞存活率。细胞存活的确定在所有形式的细胞培养中都起着重要作用[1]。
在本文中，我们将从六个方面介绍细胞存活率，包括定义、检测意义、指标、检测方法、不同检测方法的比较，以及存活率、活力和增殖之间的区别。
1. 什么是细胞存活率？
细胞存活率是一个群体中存活细胞的比例测量。细胞存活率是一个以百分比表示的相对测量。它通常与细胞健康和细胞群体的生存和成功功能能力相一致。
2. 为什么要测量细胞存活率？
细胞存活率的测量旨在量化样本中的整体健康细胞，并评估细胞对各种处理和刺激的反应。
例如，细胞存活率测定有助于筛选化学物质对各种细胞的细胞毒性，并在癌症化疗中选择抗癌药物及其剂量。
测量从组织中分离的细胞的存活率，以了解分离过程是否损伤了细胞。
在复苏后，应该检查细胞存活率，以了解冷冻和复苏的影响。
有时，细胞存活率测定也用于优化细胞培养或环境条件。
或者，细胞变异性可以用于相关细胞行为以及细胞数量，从而提供对细胞代谢的详细分析。
3. 什么是细胞存活率的指标？
细胞存活率反映了细胞群体的整体健康情况。因此，细胞膜渗透性、细胞代谢活性、ATP产生、酶活性和增殖能力可以指示细胞的存活率 [2]。
4. 细胞存活率检测方法
细胞存活率可以通过许多方法进行评估，从最简单且广泛使用的染料排除法到对ATP含量和酶活性进行高度复杂的分析。选择最佳的存活率测定方法应该详细考虑细胞类型、应用的培养条件以及所需设备的成本、速度和复杂性。
4.1 染料排除法
染料排除法是用于细胞存活率鉴定的简单且最常用的方法之一。染料排除法的原理是死细胞会吸收染料并变色，而活细胞会排除染料，因为它们具有完整的细胞膜。因此，可以使用血细胞计数器计算死细胞（着色）或存活细胞（无色）的数量。在多种使用的染料中，尝试蓝是其中最常用的。在尝试蓝染色中，死细胞被染成蓝色，活细胞则不被染色[3]。然而，凋亡细胞在染料排除法中也被计算为存活细胞，因为它们的细胞膜仍然完整。因此，在可靠的细胞存活率和健康研究中，通常会通过流式细胞术测量凋亡细胞的水平以及存活细胞的数量。
4.2 细胞增殖测定
健康细胞会积极增殖，而受限、老化、死亡或垂死的细胞则不能。因此，细胞增殖测试是评估细胞存活率的有用工具。通过测量DNA合成和免疫染色细胞周期特异性蛋白质可以进行细胞增殖测定。许多生物公司开发了基于荧光微孔板的细胞增殖测定试剂盒，用于定量细胞并评估细胞增殖。最常用的增殖蛋白包括增殖细胞核抗原（PCNA）[4]、MKI67 [5]、磷酸组蛋白H3（H3-3A）[6]和MCM2 [7]，可以通过WB、IF、IHC、流式细胞术和ELISA进行检测。
4.3 比色法测定
代谢活性通常通过检测细胞还原能力来评估。在活细胞中，NADPH将四唑盐，包括MTT、MTS和XTT还原为紫色的吗啉衍生物。MTT比色法是第一种用于适用于高通量筛选（HTS）的96孔板格式的均质细胞存活率测定方法 [8] [9]。在存活细胞中，黄色的MTT被还原为紫色的吗啉。MTT测定中产生的吗啉衍生物的数量通过在560 nm处通过分光光度法记录吸光度读数来测量，并且与存活细胞的数量直接成正比。MTS方法在原理上与MTT测定类似，但在灵敏度和操作上更高 [10]。
图. MTT试验
4.4 生物发光测定法
生物发光测定法可以快速、简单地确定哺乳动物细胞的细胞增殖和细胞毒性。细胞增殖和细胞毒性可以间接反映细胞存活率。
● ATP测定
基于ATP的细胞存活率测定是一种敏感可靠的方法。只有存活细胞能够合成ATP。内源性ATP是活细胞最基本的能源来源。当细胞死亡时，ATP会迅速水解。因此，内源性ATP含量的测定可以及时反映细胞的活性和存活率。
基于ATP的细胞存活率测定的反应原理是，在Mg2+和ATP的存在下，荧光酶催化荧光素氧化为氧化荧光素，产生与细胞内ATP浓度成比例的发光信号 [11-13]。因此，产生的信号强度间接地反映了存活细胞的相对数量 [14]。
● 实时存活率测定
实时存活率测定是一种新开发的生物发光测定法，可以在整个时间过程中监测细胞的生长。Duellman SJ及其同事在细胞培养基中添加了一种小分子前底物和一种源自海洋虾的工程荧光酶作为试剂。需要注意的是，前底物不是荧光酶的底物。在活细胞中，前底物被还原为底物，荧光酶催化产生发光信号。该发光信号可以在长时间内从样品孔中重复记录，以实时测量细胞数量 [15]。
4.5 酶活性
与非存活细胞不同，存活细胞具有神秘的活性。酯酶活性，作为底物的衡量，例如不发光的细胞可渗透染料羧基氟荧光素二乙酸酯（CFDA），通常用作总体酶活性的指标。进入活细胞后，细胞内酯酶将CFDA水解为羧基氟荧光素，这是一种带负电的荧光分子。羧基氟荧光素在活细胞中不共价地保留，并产生绿色荧光。发光强度与存活细胞的数量正相关。
5. 不同检测方法的比较
上述细胞存活率测定法各有优劣。下表分别列出了它们的特点。
| 细胞活力测定 | 优点 | 缺点 |
|---|---|---|
| 染料排除试验 | 简单迅速的;低成本;需要少量的细胞;可以检测非分裂细胞群中死亡的细胞。 | 有些染料对哺乳动物细胞有毒副作用;难以同时处理大量样品;最终结果不是很准确(包括凋亡细胞的数量)。 |
| 细胞增殖抑制试验 | 准确可靠 | 耗时 |
| 比色法 | 使用方便、安全、快速、可靠、灵敏、经济、可重复性强。 | 许多因素，包括酶调节、pH、细胞离子浓度、孵育时间、细胞类型和数量都可能影响最终结果。 |
| Bioluminometric 化验 | 速度快，灵敏，简单。 | ATP测定的灵敏度通常受到移液重复样品的可重复性的限制;最终代谢活性细胞对前底物的消耗限制了实时测定的结果。 |
| 酶活性 | CFDA对细胞无毒 | 受试化合物的荧光干扰可能影响最终结果 |
6. 细胞存活率、细胞活力和细胞增殖
细胞存活率、细胞活力和细胞增殖是细胞的三种不同生理状态。它们都反映了细胞是活着的。然而，存活率是对细胞群体中存活细胞数量的量化，而细胞增殖是在一段时间内测量细胞数量的指标 [16]。细胞存活率测定方法，如染料排除法，只是区分活细胞和死细胞。细胞增殖的测量可以监测一段时间内细胞数量、细胞分裂次数、代谢活性或DNA合成。然而，并非所有存活细胞都会分裂。尽管细胞增殖可以轻松解释为存活率，但非增殖不应自动被视为细胞死亡的标志。
除了细胞死亡，化学或物理因素的毒性效应可能导致细胞凋亡或坏死（细胞代谢和生理后果阻止细胞分裂），但细胞本身仍然可能存活 [17]。这种现象被称为“细胞活力”，即细胞的生理能力。
目前，在毒理学和药理学领域已经应用了各种细胞存活率测定方法。理想的体外存活率测定方法应该是快速、安全、可靠、高效、及时和经济，并且不干扰测试化合物。测试化合物的作用模式、组织或细胞类型在研究中的使用也会影响细胞存活率测定方法的性能。因此，在选择测试方法之前最好尝试并比较不同的方法。如果可能，在体外研究中应该使用多种检测方法来确定细胞存活率，从而获得可靠和准确的结果。
参考文献：
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