酵母双杂交自激活验证的实验步骤
日期：2023-08-21 16:47:33
酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid）是常用的蛋白质相互作用的实验技术。在进行双杂交自激活验证实验时，可以按照以下步骤进行操作：
实验前准备：
准备两个酵母菌株：一个是用于检测蛋白质自激活的菌株（例如AH109），另一个是作为质粒携带者和报告基因表达的菌株（例如Y187）。
构建融合蛋白质的载体：将待检测蛋白的编码序列克隆到适当的双杂交载体中，通常包括激活区域（AD）和DNA结合区域（BD）。
验证载体的无毒性：通过转化含有空载体的菌株来验证载体本身不会导致菌株生长异常。
转化酵母菌株：
将质粒携带者（例如Y187）和融合蛋白质的载体（例如AH109）分别线性化，然后通过化学方法或电击法将线性化DNA转化到相应的酵母菌株中。
进行选择培养：将转化后的酵母菌分别移植到含有选择性培养基的平板上，以筛选出具有正确载体的菌落。
进行交互检测：
鉴定阳性相互作用：将筛选得到的阳性菌落分别提取DNA，进行PCR扩增和序列分析，确认融合蛋白质的正确定序。
进行双杂交验证：将阳性菌株分别转化到两个不同的抗性选择培养基中（例如TDO和QDO培养基），观察是否出现报告基因（如 HIS3、Ade2和LacZ）表达的现象。
设置对照组：设置空载体对照和已知相互作用的阳性对照，以确保实验结果的准确性。
结果分析：
观察菌落生长情况：在选择培养基上观察菌落生长，阳性菌株应在TDO和QDO培养基上能够生长。
检测报告基因表达：使用相应的检测方法（如X-gal染色、HIS3和Ade2的活性检测）来测试报告基因的表达水平，以确认蛋白质的相互作用。
以上步骤仅概述了双杂交自激活验证的基本流程，具体的实验操作和条件可能因实验目的和试剂盒等不同而有所差异。在进行实验前，请仔细阅读相关文献和试剂盒的说明，并按照其中提供的操作指南进行实验。
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