膜蛋白酵母双杂交技术原理和步骤

日期：2023-06-02 11:37:11

膜蛋白酵母双杂交技术是一种常用的分子生物学实验方法，用于研究蛋白质相互作用。该技术利用酵母细胞膜蛋白作为分子载体，将两个目标蛋白质分别与酵母细胞膜蛋白的两个域连接在一起，通过检测酵母细胞的生长或转录激活来判断目标蛋白质之间是否存在相互作用。以下是膜蛋白酵母双杂交技术的原理和步骤：

一、原理

膜蛋白酵母双杂交技术利用酵母细胞膜蛋白的两个域——DNA结合域和激活域来构建分子载体。其中DNA结合域可与DNA序列结合，并具有转录激活功能的激活域可激活下游基因的转录。通过将两个要检测的蛋白质分别融合到这两个域上，形成酵母细胞膜蛋白与目标蛋白质的融合蛋白，若融合蛋白能形成复合物，则激活下游基因的转录，酵母细胞生长，反之则不生长。这样就可以通过检测酵母细胞的生长情况来判断目标蛋白质之间是否存在相互作用。

二、步骤

1、构建膜蛋白酵母双杂交载体

膜蛋白酵母双杂交载体通常包括两个部分：酵母表面膜蛋白的DNA结合域（BD）和激活域（AD）。点突变或保留的氨基酸序列将目标蛋白质或其片段接入到BD或AD中。

2、转化酵母细胞

将构建好的BD和AD载体分别转化入两个酵母菌株中，在培养基中筛选出具有BD和AD融合的酵母细胞菌落。

3、半定量或定量检测生长

将BD和AD融合的两种酵母细胞混合在含有不同浓度的抗性剂和缺失选择性基因的培养基上。如果两种酵母细胞中的融合蛋白质可以相互作用，则会激活下游的选择性基因，使酵母细胞生长，并且一定时间后成为明显的菌落。然而，如果两种酵母细胞中的融合蛋白不能相互作用，则不会生长菌落。

半定量检测方法：将要检测的酵母细胞分别稀释后点在含有不同浓度的抗性剂和缺失选择性基因的培养基上, 一般以浓度级差为1:5,1:10或1:100。培养2~4天后观察生长情况即可。

定量检测方法：将自感和杂交酵母细胞的混合物均匀涂布于含有不同抗性剂浓度的平板上后，计算细胞增殖的程度，从而确定相互作用强度的差异。

4、确认相互作用

通过对生长的酵母细胞进行重复自由浸润筛选，进一步检验融合蛋白量的特异性、真实性和重复性。可以使用其他实验来进一步证实相互作用，如质谱法、共免疫沉淀法等。

通过膜蛋白酵母双杂交技术，可以快速检测目标蛋白质之间的相互作用，并且具有灵敏度高、可重复性好的优点。该技术已成功应用于细胞信号传导和蛋白质在生命活动中的作用研究。