如何对包涵体蛋白进行表达与复性?

日期：2023-06-06 13:41:30

包涵体蛋白表达与复性的过程中，需要进行以下步骤：

一、基因克隆

1、选择适当的质粒载体

常见的质粒载体有pET系列、pGEX系列等。根据需要选择含有不同诱导子和选择标记的质粒载体。

2、扩增目的基因

将目的基因扩增后，将其接入到质粒载体的多克隆位点上。这一步可以通过PCR方法来进行扩增，也可以通过化学合成的方式获取到序列完整、长度合适的基因片段。同时，在PCR扩增过程中，应考虑到靶基因的大小和构建的质粒载体的限制酶切位点的配对问题。

3、活性测定

在将目的基因接到质粒载体后，可进行限制性酶切鉴定、DNA测序鉴定等活性测定，以确定目的基因序列是否正确。

二、转化

将质粒载体转化入大肠杆菌中，使其在细菌内表达。转化方法有化学转化法、电转化法和热激转化法等。

三、筛选阳性克隆株

转化后需要对大肠杆菌进行筛选。常用的方法是在含有抗生素的LB平板上筛选，含有适合质粒载体选择标记的抗生素（如氨苄青霉素、卡那霉素）。

四、包涵体蛋白表达

1、预培养

将大肠杆菌阳性克隆株接入到LB培养基中预培养，通常为37℃、200-250rpm振荡培养。

2、诱导表达

当大肠杆菌发展到指定的OD600值时，添加诱导剂进行表达。在此过程中应选择合适的诱导浓度和时间，不同的质粒载体可能对诱导剂的反应存在差异。

3、加入辅酶

辅酶对于某些蛋白质表达至关重要。如在pET质粒中，可以添加辅酶T7。

4、分析表达

通过采集样品、离心、液氮冻存等方法来分析蛋白表达的情况，如采用SDS-PAGE技术进行蛋白质分离，并采用Western blotting技术进行检测。

五、包涵体蛋白复性

1、包涵体蛋白的裂解

将表达的细菌分装至每个离心管中，采用超声波、热激或流体剪切的方法进行细胞裂解。对于不同类型的包涵体蛋白，应选择不同的裂解方式和时间。

2、去除杂质

将细胞裂解物经过离心去除细胞碎片等杂质，得到含有包涵体的上清液。

3、包涵体蛋白的再溶解

使用缓冲液将包涵体溶解后，使用Refolding Buffer进行复性。Refolding Buffer通常包括还原剂如DTT等，以促进蛋白的还原和复性。

4、蛋白纯化

复性过程完成后，使用亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等方法来纯化复性的蛋白质。

通过以上步骤，可以较为可靠地实现包涵体蛋白表达与复性，并进一步开展相关实验研究。