免疫组化与病理诊断

1、什么是免疫组化?

在了解免疫组化在临床上的应用之前，我们先来了解下什么是免疫组化。免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性，先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原。然后通过免疫动物后获得特异性的抗体，再用此抗体去探测组织或细胞中的同类抗原物质。由于抗原与抗体的复合物是无色的，因此还必须借助于组织化学的方法（荧光素、酶、金属离子、同位素）将抗原抗体结合的部位显示出来，以其达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性，定位或定量的研究（Figure 1）。

免疫组化针对的样本主要是组织。组织是来自患者或动物，经过冷冻或石蜡包埋。将这些组织制成约4μm厚的切片，封片后再处理。若样本是细胞，通常被称为免疫细胞化学（Immunocytochemistry，ICC）。对于ICC，大部分细胞外基质及其他基质组分被去除，只剩下整个细胞来染色。ICC的来源可以是细胞悬液，来自患者或动物（如血涂片、拭子等），或在实验室中进行的组织培养细胞系。

2、什么是病理诊断？

病理诊断是研究疾病发生发展和疾病过程中患病机体形态结构、功能代谢改变与疾病转归，从而为疾病的诊断、治疗与预防提供必要的理论基础和实践依据。

病理诊断是对手术切下或尸体解剖取下的肿瘤标本进行固定染色后，在显微镜下进行组织学检查，以便于诊断疾病。样本更多源于活人。尽管各种影像学技术飞速发展，但是病理诊断仍然是肿瘤各种检查方法中最可靠的，病理诊断被喻为“金标准”，也是疾病的最终诊断。如果将病理诊断和生化免疫等检验诊断进行比较，病理诊断就好像警察办案获得的指纹、脚印、DNA等实际证据。因其通过显微镜观察疑似病变组织的细胞形态和结构，可直接看出组织发生了怎样的病理变化，能较准确地对疾病做出判断，尤其在肿瘤性质的诊断上更为常用。而免疫组化，就是病理诊断中最常用的检测技术。

3、免疫组化技术在临床上的应用

目前免疫组化技术应用于临床主要有以下几个方面：

• 肿瘤良恶性的判断：对于反应性增生还是肿瘤性增生，可用免疫球蛋白(Ig)的轻链抗体检测B淋巴细胞增生的单克隆或多克隆性来区别。
• 确定肿瘤分期：肿瘤分期是判断预后的一个指标，与是否浸润、有无淋巴管或血管侵袭密切相关，而通过免疫组化方法可以判断肿瘤是否浸润、有无淋巴管或血管侵袭。
• 细胞属性的判定：通过特定抗体标记出细胞内相应的抗原成分，来判定细胞的属性，确定肿瘤的来源。
• 确定来源不明的转移瘤的原发部位：对于来源不明的转移瘤，用免疫组化技术有助于确定恶性肿瘤的组织学来源，进一步确定原发部位。如角蛋白抗体(CK20)在胃肠道癌、胆管癌、胰腺癌中阳性，而在肺癌、乳腺癌、肾癌中阴性。
• 对“未分化”恶性肿瘤的分类：未分化恶性肿瘤包括癌或肉瘤，在HE切片上由于肿瘤的“未分化”而缺少肿瘤细胞的起源特征不能分类，初步区分组织学类型用非特异性抗体，在其基础上再选用特异性抗体做进一步鉴定。
• 进一步分类不同器官与组织交界处肿瘤：由于重叠的特征，在一些组织器官交界处的肿瘤，仅凭组织学基础对肿瘤进行分类很困难。如发生于组织交界处的肿瘤有睾丸胚胎癌与精原细胞癌，两者较难区别，且治疗与预后显著不同，但用免疫组化检测角蛋白就较易于区别：角蛋白阴性则为精原细胞癌，而角蛋白阳性则为胚胎癌。
• 及时准确的发现微小转移灶：在常规组织切片中，辨别单个或几个转移性肿瘤细胞很难，淋巴结内窦性组织细胞增生与某些癌的早期转移有时也不易区别，而采用免疫组化方法，有助于及时准确的发现微小(癌)转移灶。

4、病理诊断中免疫组化的局限性

但是，随着免疫组化的广泛应用，发现免疫组化技术存在一些局限性。在肿瘤诊断中评估免疫组化的局限性主要在抗体特异性和解释方面。在免疫组化操作过程中中都必须有适当的阳性与阴性对照，作为技术完整性质量控制，如对照组被忽略或不理想时，免疫组化染色的结果要谨慎对待，免疫组化的正确结果，不仅要依靠技术步骤上规范化操作，而且有赖于正确的解释，在报告免疫组化染色结果时不应孤立地解释，应考虑到诊断与鉴别诊断、所应用的抗体特性、所研究组织性质，同时还要注意假阳性与假阴性结果的干扰。深入研究免疫组化原理和技术，必须熟悉各种抗体真阳性反应部位，实现实验室间免疫组化标准化，使免疫组化在病理诊断中发挥最大的辅助作用。

5、临床上常用免疫组化指标的意义

大家都知道病理检查是临床诊疗的金标准，尤其对于肿瘤患者，更是一封判决书。其中免疫组化（IHC）的结果对肿瘤的诊断和治疗及预后分析尤为重要。本文就目前开展的系列检查及意义进行了整理。

5.1 恶性肿瘤的 Ki-67 和 p53 常规检查

目前的研究表明，大部肿瘤的复发、转移取决于 Ki-67 值和 p53 值，而与肿瘤的组织的分型关系不是十分密切，如中分化腺癌，如果 Ki-67 和 p53 值超过 50%，预后不佳。相反，如肿瘤的组织分型为低分化腺癌，而 Ki-67 和 p53 值较低，预后也会较中分化或高分化癌的预后稍好。

5.2 耐药预后标记全套 4 项：P-gp，GSTπ，TOPOⅡ，Ki-67

P-糖蛋白（P-gp）--药泵作用--胞膜/胞浆--阳性率越高，对下列药物耐药性越强：阿霉素、柔红霉素、表阿霉素、米托蒽醌、长春花碱、长春新碱、紫杉醇及泰素帝。

谷光甘肽 S 转移酶（GST π）--解毒作用--胞浆--阳性率越高，对下列药物耐药性越强：阿霉素、顺铂、氮芥、环磷酰胺及瘤可宁。

拓扑异构酶Ⅱ（TOPOⅡ）--靶点作用--胞核--阳性率越高，对下列药物越有效：蒽环类抗生素和鬼臼毒素类，如 VP-16、替尼泊苷、玫瑰树碱、新霉素、柔红霉素、表阿霉素、阿霉素、VM26。阳性率高者对 VP-16 尤其有效。

Ki-67--细胞增殖标志--胞核--阳性率越高，肿瘤增殖越快，恶性程度越高。

5.3 乳腺癌五项（ER、PR、C-erbB-2(Her-2)、Ki-67、p53）

乳腺癌耐药预后标记，全套 7 项：P-gp，GSTπ，TOPOⅡ，Ki-67，ER，PR，HER2。

雌激素受体（ER）--性激素作用--胞核--阳性率越高，肿瘤对内分泌治疗越有效，预后越好。

孕激素受体（PR）--性激素作用--胞核--阳性率越高，肿瘤对内分泌治疗越有效，预后越好。

C-erbB-2--癌基因产物--胞浆--阳性率越高，肿瘤恶性程度越高。

p53 一种抑癌基因，分野生型（Wtp53）和突变型（Mtp53）。野生型 Wtp53 因微量免疫组化难以检测，突变型 Mtp53 能够被免疫组化测定，突变后则丧失了启动细胞凋亡的能力。突变型 p53 高表达，细胞的高度增生、分化程度差分化、恶性程度越高、预后不良，公认预后差指标之一。

5.4 垂体腺瘤功能六项检查

LH（促黄体生成素），FSH（卵泡刺激素），ACTH（促肾上腺皮质激素），TSH（促甲状腺素），PRL（泌乳素）、GH（生长激素）。根据某一种抗体阳性表达进行术后药物治疗。

5.5 GIST（胃肠道间质瘤）诊断

GIST 特征性表达 CD117（95%）

GIST 特征性表达 DOG1，DOG1 阳性表达部位与 CD117 相似

• DOG1 可以表达于部分 CD117 阴性的 GIST 中（6%）
• DOG1 在胃部 GIST、上皮样 GIST、PDGFRA 突变的病例中，表达率高

大多数表达 CD34（70%）、局灶性表达 SMA（40%）、S-100 蛋白（5%）、通常不表达 desmin（2%）。

标准免疫组化染色套餐是：CD117、DOG1、CD34、SMA、S-100和Desmin。可依据组织形态表现，添加需要的鉴别染色抗体。

5.6 淋巴瘤的 WHO 分型

淋巴瘤 WHO 最新分型有 33 个亚型，每个亚型的预后和治疗方案均有所不同，而淋巴瘤的诊断和分型又是极其困难的，是病理中的难中之难，所以诊断淋巴瘤的免疫组化方案必须「双份套餐式」的，即每一种组织的标记物必须用 2 种以上的抗体。

诊断 B 细胞淋巴瘤，必须有 CD20 和 CD79a 阳性正面证实，同时还需要用 CD3 阴性反面来证实，因此诊断淋巴瘤需 8-10 种左右的抗体，才能准确地反应出淋巴瘤各种亚型的信息。