CD69：淋巴细胞活化最早表达的分子，作为多向性调控者参与血液和自身免疫疾病！
日期：2023-05-24 09:51:03
近日，《Theranostics》杂志在线发表了题为HSF1 promotes CD69+Treg differentiation to inhibit colitis progression的研究论文 [1]。研究发现，CD69在维持Treg免疫抑制功能中起重要作用，Treg中敲低CD69容易诱发炎症性肠病等自身免疫性疾病。此外，HSF1通过激活CD69转录促进CD69+Tregs分化，这对Tregs的免疫抑制功能至关重要。尤其是对于治疗自身免疫性疾病的患者来说，通过增加CD69+Treg的数量将有望缓解疾病症状，改善病情进展。
CD69作为淋巴细胞活化最早表达的分子，也就是当免疫系统激活时，CD69成为最早的信号，调节T细胞、B细胞、自然杀伤细胞等多种免疫细胞的功能，因此，CD69被认为是一种多向性调控者，在免疫系统中发挥着重要的作用。越来越多的研究表明，CD69在血液和免疫疾病中发挥重要的调节作用。那么，CD69更多的生物学功能是怎样的？它在免疫调节中的机制是如何？带着疑问，让我们去一起了解探索。
1. 什么是CD69？
1.1 CD69的结构
CD69（又称AIM，EA-1，Leu23和MLR-3）是淋巴细胞活化最早表达的膜表面分子。人CD69是由199个氨基酸组成的完整的II型跨膜糖蛋白 [2]，包括40个残基的细胞内区，21个残基的跨膜区和138个残基的细胞外区。细胞外区有C-型凝集素（Ca2+依赖性糖基识别区域（CRD）），CD69亦属于C-型凝集素受体家族 [3-4]。细胞内的末端Ser/Thr通常被磷酸化，CD69与CD23、CD72有相同性 [3-4]。CD69又属于NK细胞特异的遗传因子复合体，不同的是，NKR-P1、Ly-49与NKG2分子只表达在NK细胞上，而CD69可在多种细胞上表达，说明CD69有多种特性 （图1） [2]。
图1. CD69结构示意图 [2]
1.2 CD69的表达及功能
CD69是淋巴细胞激活后最早表达的表面抗原，后来发现经诱导后它几乎可在所有的血细胞上表达。CD69可诱导表达在T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、中性和嗜酸性粒细胞、胸腺细胞等。CD69这种仅在细胞活化后表达的特性，使其成为细胞活化的标记分子。例如，T细胞活化标志分子，具有代表性的：IL-2受体CD25、转铁蛋白受体CD71、CD69，而CD69是表达最早的分子 [5-7]。
CD69也可作为细胞共刺激信号，如CD69+T细胞伴随IL-12β、IL-18α和IL-16β mRNA水平增高，并在重组IL-12或IL-18的作用下，促进干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）的产生。近年研究揭示CD69在促进细胞活化的同时，还可能与细胞的凋亡密切相关 [8-9]。虽然CD69的配体还未明确，有研究提示CD69可能与Galectin-1（Gal-1）结合调控Th17（图2） [8]。总之，CD69交联可产生细胞内信号传导及多种免疫反应，对造血细胞的生物学功能有广泛的作用。
图2. CD69可能与Galectin-1（Gal-1）结合调控Th17 [8]
2. CD69在细胞活化和凋亡中的双向免疫调节机制
CD69是一个多向性的免疫调节分子，对多种造血细胞的活化和分化具有重要作用。CD69自被发现后，初始研究基本上是关于CD69在细胞活化中的作用。近年来发现，CD69在T细胞凋亡中亦有重要作用。CD69介导细胞活化和细胞凋亡的分子机制仍不明确。
2.1 CD69和细胞活化
静止状态的T细胞不表达CD69，但当T细胞受抗CD3/TCR（T cell receptor，TCR）、CD2、CD28、蛋白激酶C（PKC）的激活物PMA、PHA等刺激活化后可诱导性表达CD69。
在CD69介导的T细胞活化中CD3/TCR复合体是必要的（图3） [10]。PMA通过激活GTP连接和Ras蛋白参与了细胞内的信号传递，这对于T细胞上CD69的表达起到了核心作用。
图3. CD69介导的T细胞活化中CD3/TCR复合体是必要的 [10]
NK细胞在静止状态也不表达CD69，当IL-2、IL-7、IL-12、IFNA、PMA和CD16交联可使NK细胞活化，诱导CD69的表达 [10-11]。多种不同信号转导中的蛋白激酶 C（protein kinase C，PKC）和蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase，PTK）参与其中 [10-11]。CD69启动的NK细胞细胞毒活性受CD94的调节 [12]；另有报道CD69能活化细胞外信号调节激酶ERK，而CD69启动的ERK活化受CD94/NKG2-A抑制性受体的负调节 [13]。
对脾脏和淋巴结中的B细胞，脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）可诱导其CD69分子表达；对外周血液中嗜酸性粒细胞EOS，体外IL-2、IL-3、IL-5、IL-13、GM-CSF、IFN-γ可诱导CD69表达 [14-15]。
2.2 CD69和细胞凋亡
CD69在体内与细胞的凋亡密切相关。在体内活化的具有CD69高表达的T细胞，在体外易于快速自发凋亡。与死亡受体CD95相比，CD69介导的凋亡有其自己的特点。CD95介导的凋亡几乎涉及所有细胞类型，而明确可由CD69介导的凋亡细胞为T细胞、活化的嗜酸性粒细胞EOS和单核细胞。
研究提示CD69介导的单核细胞凋亡与3个不同的信号通路相关：1）依赖于NO；2)与磷脂酶A2/磷脂氧化酶级联反应相关；3)受百日咳毒素（PTX）敏感的G蛋白影响；4）CD69介导TGF-β合成 [16]。
Caspase是一类在细胞凋亡过程中起关键作用的分子。EOL-1株EOS在CD45、CD45R、CD45RB、CD95、CD69单抗培养后，凋亡增加，caspase-8和caspase-9抑制剂可抑制单抗诱导的凋亡；CD69交联可诱导caspase-3、caspase-8激活。抗CD69单抗可诱导EOS凋亡及bcl-2表达下降，但在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF存在，胞内bcl-2浓度不变时，CD69单抗可诱导GM-CSF培养的CD69+细胞凋亡，bcl-2表达下降，提示CD69诱导的凋亡与bcl-2依赖的信号转导有关 [17]。
成熟T细胞活化诱导凋亡机制可能是FAS，研究发现，体内激活的具有CD69高表达的扁桃腺T细胞体外易于自发性和快速凋亡，细胞趋化因子CXCL12/SDF-1、TIL16、IL17、IL12、IL15等可抑制凋亡；磷酸酰肌醇3激酶（PI3K）抑制剂可加速凋亡，提示体内激活CD69+T细胞有内源性的凋亡敏感性的增加，而其机制涉及多种外源信号 [18]。
3. CD69在疾病中的作用
CD69作为T淋巴细胞激活后最早表达的表面分子，是T细胞介导的免疫应答的重要组成。当其表达之后，可通过提高Ca2＋浓度、上调细胞内TNF-α、IFN-γ等细胞因子的分泌以及IL-2及其受体的合成与表达，并作为共刺激信号促进T细胞进一步活化和增殖。现有研究表明，CD69对多种血细胞的激活、增殖和分化起重要作用，并与血液系统疾病及免疫相关性疾病的发病机理有关。
3.1 CD69和血液系统疾病
在多种血液系统恶性肿瘤（包括淋巴瘤、急性或慢性白血病、多发性骨髓瘤）外周血淋巴细胞亚群中发现，CD4+和CD8+的T细胞上CD69、CD71等活化标志分子表达明显增加，说明这类疾病存在T细胞激活。
急性髓系白血病（（Acute myeloid leukemia，AML）起源于造血干细胞的异常增殖和分化。在AML中，白血病细胞不成熟并快速增殖，最终会取代正常造血组织，导致贫血、感染和出血等症状。在AML中，CD69表达率明显降低。由于CD69的缺乏，一系列细胞因子，如IL2、TNF-α等分泌亦减低，难以形成效应T细胞而产生免疫应答。经化疗获得完全缓解后，CD69表达率则明显升高，表明AML患者存在T细胞活化受抑、免疫功能受损 [19]。
慢性淋巴细胞白血病（Chronic Lymphocytic Leukemia，CLL）是一种以CD5+CD19+B淋巴细胞克隆性增殖为特征的恶性增生性疾病。在CLL中，用丝裂原体外刺激B细胞，发现CD69的表达与正常对照相似，但CD95的上调性表达受损。进一步研究揭示CLL患者瘤细胞表达CD23，CD25，CD69，CD71等表面活化抗原，而CD69表达水平可能与CLL患者外周血淋巴细胞数目、更差的临床分期等因素密切相关 [20]。
在骨髓增生异常综合征（Myelodysplastic Syndromes，MDS）单核细胞中，CD69的表达量明显增加，这可能与MDS患者免疫功能失调有关。CD69的高表达可能会导致单核细胞对病原体的清除能力下降，从而使MDS患者更容易感染。
3.2 CD69和自身免疫相关性疾病
对于CD69的研究大都集中在系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病上。这些研究发现CD69在自身免疫性疾病患者外周血中处于高表达状态，经有效治疗后，CD69表达水平明显回落，且CD69水平与疾病的活动明显相关。
系统性红斑狼疮（Systemic Lupus Erythematosus，SLE）是以T、B淋巴细胞功能改变为特征的自身免疫性疾病。在刺激实验中，SLE患者的淋巴细胞CD69表达比正常人群细胞呈高反应，且SLE病人淋巴细胞对多种刺激表现适度的增殖。然而，SLE患者CD4+和CD8+T细胞，CD69的表达无明显差异，提示CD4+和CD8+T细胞的活化，均需CD69的参与，CD69所起的作用很可能是在活化早期传递活化信号 [22]。
在类风湿性关节炎（Rheumatoid Arthritis，RA）滑膜液中，CD4+和CD8+T淋巴细胞CD69的表达均升高，表明这两个T细胞亚群均被激活。对比RA、血清阴性脊柱关节病（SSd）和结晶体关节炎（CAA）三组患者在关节滑膜液中CD69的表达，发现CD69+淋巴细胞的百分比在三组患者中没有差异，但是RA患者关节滑膜液中CD69表达水平最高。此外，RA组患者的淋巴细胞CD69表达与滑膜液IL-15水平相关 [23-24]。
在自身免疫性心肌炎的小鼠中，CD69能通过调节心脏特异的Th17细胞来负性调节心肌炎症。Th17细胞是一种免疫细胞，其参与了多种炎症性疾病的发生和发展过程，包括心肌炎。在体内CD69能通过活化Jak3/Stat5通路调节T细胞向Th17细胞分化 [25]。
图4. CD69调节T细胞向Th17细胞分化 [28]
3.3 CD69和其它疾病
有研究表明冠心病（Coronary Heart Disease，CHD）患者的CD69、DKK-1、IL-10、IL-6、TC、TG、LDL高表达，并且随着冠脉狭窄病变程度加重 [26-27]。早期研究还揭示，哮喘患者气道中T细胞有CD69表达，在细胞激活后，CD69通过对TGF-β生成与分泌的调节来激发T细胞的凋亡 [28]。CD69诱导活化细胞凋亡功能为哮喘治疗提供新思路。另有学者在实体瘤（胃癌、肝癌、大肠癌等）的研究中发现，患者外周血CD69表达水平明显减低，并与肿瘤分期呈负相关，手术切除病灶或化疗后，CD69表达水平则有所回升 [29-31]。
4. 靶向CD69的研发药物及临床意义
最新的Pharmsnap数据显示，GeneFrontier Corp.正在临床前模型中验证一款针对CD69的单克隆抗体药物（GFC-101），可用于治疗肠易激综合征、类风湿关节炎以及呼吸障碍。作为细胞最早表达的激活蛋白，CD69可以引发一系列免疫反应。目前，更多干预CD69表达水平的药物或抗体正在进一步研究中，例如，在治疗CLL患者时，高表达CD69的瘤细胞不太容易受到苯达莫司汀（Bendamustine）的影响，相比之下，外周血细胞则更容易受到影响。预先使用B细胞受体抑制剂降低CD69水平可能有助于减少苯达莫司汀低应答病例的发生 [32]。
此外，CD69的配体及生物功能等目前仍未探清。近期的研究表明，Gla-1可能是CD69的一种配体，与CD69分子胞外结构结合。这种Gla-1-CD69配受体结合方式代表了一条新的通路，可控制Th17介导的炎症和炎症带相关组织损伤 [8]。最新研究发现CD69还可通过与S1PR1结合，激活S1PR1并导致其内化，在淋巴细胞活动中发挥重要的调节作用 [33]。随着对CD69研究的深入，我们将获得更多关于CD69的生物学功能和临床应用方面的重要信息。未来，在血液病和自身免疫疾病治疗中，有望开发以CD69为靶点的新型免疫治疗方法。
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CD69 蛋白：
Recombinant Human Early activation antigen CD69(CD69),partial (Active)
Recombinant Human Early activation antigen CD69(Cd69),partial,Biotinylated
by SDS-PAGE
The purity was greater than 96.7% as determined by SDS-PAGE. (Tris-Glycine gel) Discontinuous SDS-PAGE (reduced) with 5% enrichment gel and 15% separation gel.
Immobilized Human CD69 at 2μg/mL can bind Anti-CD69 recombinant antibody (CSB-RA004952MA1HU), the EC50 is 23.17-26.04 ng/mL
by SDS-PAGE
The purity was greater than 90% as determined by SDS-PAGE. (Tris-Glycine gel) Discontinuous SDS-PAGE (reduced) with 5% enrichment gel and 15% separation gel.
CD69 稳转细胞株：
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