大肠杆菌抗原抗体分离结合纯化效价测定

日期：2023-05-16 13:11:44

大肠杆菌可以引起各种疾病的肠道细菌。为了研究大肠杆菌感染机理，需要对其抗原和抗体进行分离、结合和测定。本文将介绍大肠杆菌抗原抗体分离结合纯化效价测定的相关技术和方法。

一、大肠杆菌抗原制备

制备大肠杆菌抗原通常有两种方法：

培养和收集大肠杆菌

首先需要培养大肠杆菌。将大肠杆菌接种到含有适当营养物质的培养基中，通过摇床或震荡培养。然后，将培养出的细胞收集下来，通过离心、洗涤等步骤得到细胞沉淀作为抗原。

表达大肠杆菌蛋白

另一种方法是利用重组DNA技术，将大肠杆菌蛋白质基因克隆到表达载体中，并在无菌条件下转化到大肠杆菌中进行表达。表达完成后，将大肠杆菌收集下来，将其破裂并收集蛋白质以作为抗原。

二、大肠杆菌抗体制备

制备大肠杆菌抗体的方法通常有以下几种：

培养细胞得到多克隆抗体

将抗原注射到动物体内，让其产生相应的免疫反应。然后收集动物的血清，并通过不同的方法制备出多克隆抗体。例如，可以采用亲和层析纯化法、SDS-PAGE电泳法等。

重组抗体技术

除了动物血清制备多克隆抗体外，也可以利用重组DNA技术制备单克隆抗体。通过基因克隆和表达技术，得到重组的单克隆抗体。这类抗体具有高特异性和高亲和力，适用于各种免疫学和生物学实验。

三、抗原-抗体结合实验

抗原-抗体结合实验通常使用ELISA法进行测定。以下是步骤：

涂覆抗原

将抗原溶液加入微孔板中，放置在4℃下过夜，使其牢固地附着在板上。

遮蔽无特异性结合

将微孔板里的抗原溶液弃去，再加入蛋白质（如牛血清蛋白）等有机物，防止与特异性抗体结合。

加入稀释后的抗体

将稀释后的抗体加入到孔中，与抗原作用。对于多克隆抗体，可以选择一定稀释度；对于单克隆抗体，通常使用较高的稀释度。

加入次级抗体标记

添加次级抗体（如HRP标记的抗鼠IgG抗体或抗兔IgG抗体），与抗体作用，用以标志检测到的特异性抗体。

加入底物

加入色素底物，观察颜色变化。

读取结果

利用酶标仪等设备读取样品吸光度数据，计算出抗原-抗体结合效价值。

四、纯化方法

分离和纯化大肠杆菌抗原和抗体通常采用以下几种方法：

凝胶过滤层析法

这是一种基于分子量差异的分离方法。将待分离的混合物加入到凝胶柱中，大分子会被凝胶过滤，小分子则能够渗透进入凝胶孔中，从而实现分离。

阴离子交换层析法

这是一种基于电荷差异的分离方法。将待分离的混合物加入到阴离子交换柱中，大分子具有更多的负电性，会与阴离子交换树脂发生静电作用，从而被分离。

亲和层析法

这是一种基于特异性结合的分离方法。在亲和层析柱中填充配体（如亲和素或抗体），然后将待分离的混合物通过柱子，特异性结合的物质可以被捕获并从柱子上洗脱出来。

逆向相色谱法

这是一种基于极性差异的分离方法。逆相色谱柱内充满了疏水性树脂，样品中的组分在柱子中因极性不同而分散。此时，小分子化合物能够渗透到树脂孔径中，而大分子组分则难以渗透，从而实现分离。

五、效价测定

抗原-抗体结合效价测定是一种常见的免疫学实验方法，用于评估抗体对待检物质的特异性识别能力。具体步骤包括：

确定抗原标准品

选择合适的抗原，并制备出不同浓度的抗原标准品作为参考。

确定抗体稀释度

选择合适的抗体，并制备出一系列不同稀释度的抗体溶液。

建立ELISA系统

将抗原溶液加入微孔板中，加入上述稀释后的抗体溶液进行ELISA实验，最终使得酶反应产生的颜色可以被观察到。

读取数据

使用酶标仪读取阳性和阴性对照以及标准抗原之间的差异。

计算效价

根据标准曲线计算待测样品的效价值。

大肠杆菌抗原和抗体的分离、结合和测定是研究大肠杆菌感染机理和疫苗研制的重要手段。在实际应用中，需要根据具体情况选择合适的技术和方法，以获得准确、可靠的结果。