泛素化酵母双杂交原理
日期：2023-07-14 16:59:20
泛素化酵母双杂交（ubiquitin-based yeast two-hybrid）是一种用于研究蛋白质相互作用的实验方法。其原理基于以下几个关键步骤：
构建表达载体：将目标基因的编码区域连接到一个包含泛素序列的表达载体上。这样，在目标基因翻译产生的融合蛋白中，泛素序列会紧密连接在其N-末端。
融合蛋白表达：将构建好的表达载体导入酵母细胞，并利用适当的诱导剂刺激目标基因的表达，从而使细胞内产生融合蛋白。
靶蛋白与泛素酶相互作用：泛素酶（E3酶）在细胞中负责泛素化作用，将泛素共价连接到目标蛋白上。在泛素化酵母双杂交中，使用的泛素酶通常是酵母细胞自身的E3酶。
活性酶域重组：当目标蛋白被泛素化后，在酵母细胞中的特定酶域（例如，埃尔氏酵母中的乙酰胆碱酯酶）可与泛素连接的蛋白发生特异性相互作用。
双杂交检测：通过对酵母细胞进行适当的选择筛选，识别出与目标蛋白相互作用的酶域。常用方法包括生长选择实验和报告基因检测等。
通过这种方法，我们可以鉴定目标蛋白与其他蛋白之间的物理相互作用，并进一步研究与其相关的信号通路、调控机制等生物学问题。
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